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2018/04/18.

 地中海贫血(thalassemia)是最常见的单基因遗传病,属常染色体隐性遗传,主要包括α- 地中海贫血和β- 地中海贫血。最新的流行病学调查发现,β- 地中海贫血世界的平均流行率达 4.9%;我国广西、广东、海南三省高发,人群中的携带率为 1%-7%,其中重型β- 地中海贫血的发生率达 0.4%。

糖化血红蛋白 A2 检测的临床意义及存在问题

    糖化血红蛋白 A2(HbA2)作为诊断β- 地中海贫血的指标,其重要价值在很久之前就被证实。在临床工作中,仅仅利用轻微增加的 HbA2 值诊断是否为β- 地中海贫血携带者仍存在一些技术难题。

    由于随机突变多样性的存在,加之缺铁性贫血或者δ- 地中海贫血可能使疾病表型复杂化。基于在 HbA2 正常与异常值之间差别较小的缘故,在 HbA2 检测环节做好严格的质量控制,对于准确诊断疾病、特别在遗传咨询时对夫妻双方做风险评估方面起关键性的作用。

    鉴于此,国际生化协会(IFCC)工作组在 2004 年成立,该工作组(IFCC WG-HbA2)致力于解决 HbA2 检测的标准化问题。但到目前为止,对于标准化没有一个完善的共识。

    但有几点意见已经提到议程:利用现代自动化的技术(如 HPLC、CE)确保准确性在±1%(变异系数为 2%),就结果的真实性而言要保证没有偏差,总相对误差建议控制在 7.0%,诊断介值为 3.6%(除外 MCV 和 MCH),如果考虑生物易变性的话,总误差要求在 4.5%。 

    国际生化协会 IFCC 对标准物质的研发、参考范围的确定等问题进行规范化管理,以提高其检测标准化。发表在 Clinica Chimica Acta 杂志上的一篇文章,对标准化进程进行综述,该文章由意大利的 Renata Paleari 和 Donatella Caruso 等人完成。

目前 HbA2 检测现状

    据文献显示,HbA2 诊断β- 地中海贫血的截断值在 3.3%-3.7% 之间变动。国外学者近期的大量研究证明:实验室内部偏差在方法要求范围之内,而在方法之间却存在显著性的差异,很明显各类检测方法还没有达到完全的均一性。目前,HbA2 自动化检测方法还没有达到一个最佳的水平,实现方法的预期最佳状态,还需进行更多标准化的工作。

制定参考测定程序  

    在标准化管理进程中,一个很重要的工作是建立参考测定程序,包括检测方法和报告方式,其中检测方法主要建议采用液相色谱 - 电喷雾质谱(LC-ESI/MS)和同位素稀释质谱法(ID-MS), 报告方式采用百分比(%,HbA2 占总血红蛋白量的比值)。

    推荐使用的检测方法以完整珠蛋白链定量为基础,除去了传统方法中的消化环节,能避免胰蛋白酶链的干扰,两种方法均在权威实验室建立并得到条件的优化,工作组建立这两种方法还主要用于验证参考品性能,重新校准常规的方法。建立参考实验室网络,利用这两种不同并且独立的操作程序显示出独特的优势。

以通过认证的标准品验证结果的准确性

    在 HbA2 检测过程中,通过认证的标准品(CRM)也是必要的, 相关机构明确规定要使用高溯源性的标准品 --- 对于不同的测量方法,得到一致性高的结果。

    对于 CRM 有一定的要求:首先,根据试剂的变动,CRM 应该有合适的参考值,并且该参考值通过不同的检测方法验证或者根据国际认可的参考测定程序(RMP)定义; 其次,CRM 应该有充足的均一性、长期的稳定性、与临床标本具有可替代性(减少校准偏差)。

    目前唯一受业内认可的标准品是世界卫生组织(WHO)国际参考试剂(89/666,NIBSC,UK),该标准品的 HbA2 值为 5.3%±0.07%,该标准品溯源到 25 年前,其在 HbA2 检测方法上可替代性的特点已经引起质疑,而且在不远的将来,其将被淘汰,因此 IFCC WG 部分成员和参考材料与测量研究所(IRMM)合作致力于新的 CRM 的研发。

    新的 CRM 包括重新合成品和冻干形式。首批实验证明,新的 CRM 包含正常的 HbA2 基质,并且总血红蛋白(浓度为 129 g/L)、高铁血红蛋白(MetHb,1%)与新鲜血液中量基本一致。对新的 CRM 的稳定性验证发现:重新合成的材料储存在 4℃ 条件下,至少 2 周内 HbA2 量不会有变化;对于冻干形式的材料进行了 4 年多的研究,储存在 -20℃ 条件下,HbA2 量无变化,并且没有检测到降解产物或者氧化反应的发生,储存在 4℃ 条件下,HbA2 量基本能保持 2 年的时间,但是可以检测到 MetHb 轻微的增加(大约 6%)。

    因此,对于标准品的长期储存,应在 -20℃ 以下条件。经过以上的验证可以肯定新的 CRM 的应用价值:在 HPLC 和毛细管电泳技术前提下,应用于人体血液 HbA2 浓度的检测。

考虑影响地中海贫血诊断标准化的因素

    临床医生和实验室专家经常会一起讨论:哪些因素可能会影响地中海贫血诊断的标准化?先让我们了解下关于糖化血红蛋白(HbA1c)在诊断糖尿病上的标准化问题:在美国人口中的 3 百万青年进行调查发现,排除糖尿病家族史,以 HbA1c 界值 6.5%(48 mmol/mol),发生率为 1.6%。

    针对 HbA2,对 7 百万人口的流行病学调查,HbA2 值在 3.3-3.7% 的范围内,β- 地中海贫血的发生率为 2%,说明 HbA2 在β- 地中海贫血中的诊断中具有重要的意义,可见方法的真实性非常重要,在地中海贫血诊断标准化过程中,流行病学调查这一影响因素不容忽视。

在新的标准化指南出台之前,仍有许多的问题亟待解决:

1. 备选择的测定方法至少需要在 3 个独立实验室得到性能验证。

2.HbA2 标准物质至少包括两个水平,并且至少能够使用 5-10 年。

3. 生产厂家必须使用有证标准物质(CRM)验证他们的方法。

4. 建立稳健的室间质评体系,保证实验室检测质量,并且为满足临床需要,建议确保 HbA2 测定的总误差不高于 7%。

    问题的解决不只是试剂生产厂家和检验人员的事,需要和政府、国际组织等共同努力。

    β- 地中海贫血诊断中,准确测定 HbA2 值至关重要。HbA2 测定的标准化对临床医生诊断疾病方面起着关键性的作用,因此 HbA2 检验标准化问题亟待解决。但 HbA2 诊断β- 地中海贫血标准化指南的出台并不是一件简单的事情,其不单单限于检测这一环节,与β- 地中海贫血诊断相关的事件,如地区流行率、家族史、产前诊断与遗传咨询等都应涉及。(来源于:丁香园)